Original research article

Korean Journal of Soil Science and Fertilizer. 28 February 2023. 12-26
https://doi.org/10.7745/KJSSF.2023.56.1.012

ABSTRACT


MAIN

  • Introduction

  • Materials and Methods

  •   연구 지역 및 시료 채취

  •   이화학적 분석 방법

  •   항생제 표준물질 및 시약

  •   시료 전처리

  •   고체상 추출

  •   LC-MS/MS 분석

  •   분석법 검증

  •   통계 분석

  • Results and Discussion

  •   이화학성 분석 결과

  •   농업 환경 시료에서의 잔류 항생제 분포 특성

  •   잔류 항생제의 계절적 분포 특성

  • Conclusions

Introduction

축산용 항생제 (veterinary antibiotics, VAs)는 가축의 질병 예방이나 성장 촉진 등을 위해 예로부터 널리 사용되어왔으며, 축산물 생산성이나 축산 농가의 소득 증대에 기여하는 등 그 이점으로 인해 현대 축산업에서 중요한 요소가 되었다 (Hao et al., 2014). 특히 전 세계적으로 식품 소비, 특히 축산물에 대한 소비가 지속적으로 증가하면서 가축 사육량과 그에 따른 축산용 항생제의 수요도 증가하였다 (Sarmah et al., 2006; Thornton, 2010). 하지만 이처럼 축산용 항생제의 사용량 증가 및 무분별한 오 ‧ 남용으로 인해 환경 중으로 유입되는 잔류 항생제의 양이 증가하였으며, 토양, 하천수, 작물체 등 다양한 매체에서 검출되는 빈도가 증가하는 등 신종오염물질 (contaminants of emerging concern, CEC)로 떠오르고 있다 (Baquero et al., 2008; Kemper, 2008; Snow et al., 2017). 또한 환경 중으로 방출된 잔류 항생제는 환경 중 항생제 내성 유전자 (antibiotic resistance genes) 및 내성 박테리아 (antibiotics resistant bacteria)를 증가시키며, 이는 감염성 질병의 치료 효율을 저하시키는 등 가축 및 인간의 건강에 큰 문제가 되고 있다 (Ashbolt et al., 2013; Grenni et al., 2018). 가축에 투여된 항생제는 최대 90%까지 체내에서 대사되지 않고 모화합물 (parent compound)의 형태로 분뇨를 통해 배출되며 (Jjemba, 2002; Montforts, 2005), 이들은 주로 작물의 양분 공급 및 토양 질 개선 등을 위해 퇴비나 액비의 형태로 토양 중으로 유입된다 (Larney et al., 2006). 또한 토양 중으로 유입된 잔류 항생제는 강우로 인해 지표수나 지하수로 유출될 수 있으며, 관개수의 형태로 또다시 토양으로 유입될 수 있고 (Qiao et al., 2012; Boy-Roura et al., 2018), 작물에 영향을 미칠 수 있다 (Choe et al., 2021). 이처럼 농업 환경 중으로 유입된 잔류 항생제는 다양한 자연적, 계절적 또는 인위적 영향을 받을 수 있으며, 환경 중 이들의 분포는 같은 장소라 할지라도 시시각각으로 변할 수 있다. 하지만 농업 환경 중 잔류 항생제에 대한 다양한 연구에서는 오염도 파악 시점이 연속적이지 않으며, 항생제의 계열별로 잔류 특성이 다르기 때문에 시기에 따라 오염 정도를 평소에 비해 과소 또는 과대평가할 수 있다. 게다가 실제 농업 환경에서는 항생제 계열별로 다른 이화학적 특성 (극성, 수용해도, 환경 중 반감기 등)과 지역마다 다른 토양 (토성, pH 등) 및 기후 특성을 가지고 있어 같은 항생제 계열 및 종류라 할지라도 지점 및 지역별로 농업 환경 중 잔류하는 정도가 상이하며, 농업 환경 중 잔류 항생제 오염 관리 및 예방을 위해 이들의 분포 특성을 파악하는 것은 필수적이다. 따라서 본 연구에서는 농업 환경에서 국내 축산용 항생제로 사용되는 penicillin 계열 2종 (ampicillin, penicillin G), tetracycline 계열 3종 (chlortetracycline, oxytetracycline, tetracycline), macrolide 계열 2종 (spiramycin, tylosin), sulfonamide 계열 4종 (sulfadiazine, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole)를 대상으로 잔류 항생제 모니터링을 실시하였으며, 이를 통해 축산용 항생제의 계절적 분포 특성 파악 및 항생제 오염의 관리 및 대책 방안의 기초자료로 활용하고자 하였다.

Materials and Methods

연구 지역 및 시료 채취

농업 환경 중 잔류 항생제 모니터링은 충청남도 청양군에 위치한 농경지 인근에서 수행되었고 (Fig. 1), 시료 채취는 2022년 4월과 7월, 총 2번 진행하였다. 연구 지역 내에는 가축분뇨 공동자원화시설 (퇴비화 및 액비화 시설)이 위치해 있으며, 농경지 주위로 금강의 지류인 지천 (枝川)이 흐르고 있었다. 농업 환경에서 잔류 항생제의 계절별 분포 특성을 파악하기 위해 시료 채취 시기는 가축분 퇴비가 시비된 이후인 4월과, 장마철이 끝난 뒤인 7월로 선정하였다. 시료 채취는 가축분 퇴비 및 액비화 시설의 반경 1.0 km 이내의 농경지 토양 10점 (논 토양 6점, 밭 토양 4점)과 하천수 및 저니토 각각 5점, 시설에서 제조한 가축분 퇴비 및 액비를 각각 1점씩 채취하였다. 농경지 토양은 토양 표면의 유기물층 (organic layer)을 제거한 뒤 표토층 (0 - 15 cm)을 토양시료채취기 (soil auger)를 사용하여 채취하였으며, 저니토 시료는 스테인리스 모종삽 (stainless steel trowel)을 사용하여 채취하였다. 이때 토양 및 저니토 시료의 균질성 및 대표성을 위해 서로 다른 위치에서 시료를 채취한 뒤, 폴리에틸렌 봉투에 넣어 하나의 시료로 합쳐 충분히 섞어주었다. 가축분 퇴비 및 액비 시료는 농촌진흥청에서 고시한 비료의 품질검사방법 및 시료채취기준에 따랐으며, 퇴비의 경우 시료의 균질성을 위해 원추4분법으로 채취하였고, 액비 시료는 액비저장조에서 채수병으로 1 L씩 채수하였다. 모든 농업 환경 시료는 채취 후 아이스박스에 담아 실험실로 운반하였으며, 분석 전까지 4°C에서 냉장보관 하였다. 이후 수집된 토양과 저니토 및 가축분 퇴비 시료는 암조건에서 풍건 후 2 mm 표준체로 체거름하여 이화학적 분석과 잔류 항생제 분석을 진행하였다.

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Fig. 1.

Map of the study area and sampling locations. Sample collection was conducted twice in April and July 2022. Sampling sites for arable soil were selected as arable land within a radius of 1 km from the livestock manure recycling facility (a total of 10 sites marked in red). Sediment and surface water were collected at five sites according to the flow of the stream (marked in blue). Livestock manure compost and liquid manure were also collected once per period.

이화학적 분석 방법

토양과 저니토, 가축분 퇴비의 pH 및 전기전도도 (electrical conductivity, EC)는 시료와 초순수를 1:5 (w w-1, 토양, 저니토) 및 1:10 (w w-1, 가축분 퇴비)의 비율로 혼합한 뒤 진탕기를 이용하여 30분간 진탕한 후 각각 pH meter (Orion Star™ A111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)와 EC meter (SevenCompact™ Conductivity Meter S230, Mettler Toledo, Columbus, OH, USA)를 이용하여 측정하였다. 토양 및 저니토 내 유기물 함량 (soil organic matter, SOM) 분석에는 Walkley & Black법 (Walkley and Black, 1934)을 이용하였으며, 가축분 퇴비의 유기물 함량은 600°C 회화로를 이용한 감열감량법을 이용하였다.

항생제 표준물질 및 시약

분석 대상 항생제의 표준물질인 ampicillin, penicillin G sodium salt, chlortetracycline hydrochloride, oxytetracycline hydrochloride, tetracycline hydrochloride, spiramycin, tylosin tartrate, sulfadiazine, sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole은 모두 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였으며, 내부표준물질 (internal standard)로 AccuStandard (New Haven, CT, USA)사의 simeton을 사용하였다. 시료 전처리 과정에서 사용되는 hydrochloric acid 및 sulfuric acid는 Samchun Pure Chemical Co., Ltd. (Pyeongtaek, Korea)에서 구매하였으며, sodium phosphate dibasic, formic acid, ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2-EDTA)는 Sigma-Aldrich에서 구매하여 사용하였다. 이동상 조제 시 사용된 water와 acetonitrile은 HPLC 등급으로 사용하였으며, 모두 J. T. Baker (Philipsburg, NJ, USA)에서 구매하였다. 시료의 전처리 과정에서 사용된 citric acid, formic acid, ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2-EDTA), sodium phosphate dibasic은 Sigma-Aldrich에서 구매하여 사용하였으며, 이외에 hydrochloric acid, sulfuric acid는 Samchun Pure Chemical Co., Ltd. (Pyeongtaek, Korea)에서 구매하였다.

시료 전처리

농업 환경 시료에서의 잔류 항생제 분석법은 다음과 같다. 먼저 토양, 저니토 및 가축분 퇴비와 같은 고상 시료 1.0 g을 centrifuge tube에 칭량하고 McIlvain buffer (pH 4.0) 20 mL와 5% Na2-EDTA 250 µL를 넣은 후 진탕기를 사용하여 15분간 진탕한 뒤 15분간 4,000 rpm으로 원심분리 후 상등액을 250 mL 삼각플라스크에 옮겨 담는다. 상등액을 분리하고 남은 시료는 위 추출 방법과 동일하게 다시 한번 진행하였다 (총 2회 추출). 추출된 상등액 약 40 mL에 초순수를 넣어 총량이 120 mL가 되도록 한 뒤 0.2 µm cellulose acetate membrane filter로 감압 여과한 후 고체상 추출법으로 정제하였다. 하천수 시료는 분석 전 0.2 µm membrane filter로 감압 여과하여 부유물을 제거하였으며, 가축분 액비는 초순수에 1:100 (v v-1)의 비율로 희석한 뒤 여과하였다. 이후 여과된 액상 시료 120 mL를 250 mL 삼각 플라스크에 취한 뒤, 40% (v v-1) sulfuric acid를 이용하여 시료의 pH를 2.5±0.1로 조절하였다. 이후 5% (w v-1) Na2-EDTA를 500 µL 첨가한 뒤 진탕기를 이용하여 15분 동안 진탕 후 고체상 추출법으로 정제하였다.

고체상 추출

액상으로 추출된 농업 환경 시료는 SPE vacuum manifold (Supelco, Bellefonte, PA, USA)를 이용하여 고체상 추출 과정을 수행하였다. 시료를 적재하기 전 SPE cartridge에 methanol, 0.5 M hydrochloric acid, 초순수를 각각 3.0 mL씩 차례로 통과시켜 카트리지를 활성화시켰다. 이후 추출된 시료를 teflon tube를 이용하여 4 mL min-1의 유속으로 적재하였다. 시료가 카트리지를 모두 통과하면 초순수 3.0 mL를 3번에 나누어 통과시켜 카트리지를 세척하였다. 이후 내부표준물질인 simeton (0.24 mg L-1)을 50 µL를 15 mL glass centrifuge tube에 넣고 SPE vacuum manifold에 장착하였고, methanol을 2.5 mL씩 2번 가하여 (총 5.0 mL) 카트리지에 흡착된 항생제를 추출하였다. 추출된 항생제는 질소농축기 (12 position N-EVAP nitrogen evaporation system, Organomation, MA, USA)를 이용하여 40°C 이하에서 50 µL까지 농축시켰으며, 이후 이동상 A (0.1% formic acid in HPLC-grade water)를 70 µL 첨가한 뒤 진동 혼합 후 0.22 µm nylon filter가 포함된 1.5 mL centrifuge tube에 넣어 13,000 rpm으로 3분간 원심분리 하였다. 최종적으로 filter를 통해 여과된 여과액을 glass vial insert (250 µL)를 꽂은 2.0 mL 갈색 바이알에 옮겨 담아 분석 전까지 -20°C에서 냉동 보관하였다.

LC-MS/MS 분석

시료 중 잔류 항생제의 정성 및 정량 분석에는 Agilent 1290 infinity II HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, USA)와 전기 분무 이온화 (electrospray ionization, ESI) 장치가 장착된 삼중 사중극자 질량분석기 (6500 Qtrap, SCIEX, Framingham, MA, USA)를 연결한 LC-ESI-MS/MS를 이용하였으며 모든 분석 대상 항생제는 양이온 모드 (positive ion mode)에서 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring, MRM)방식을 이용하여 분석하였다. 극성의 작용기를 가지고 있는 분석 대상들의 효과적인 HPLC 분리를 위해 역상의 C18 column (Zorbax Eclipse Plus-C18 column, Agilent, 4.6 × 150 mm, 3.5 µm)을 이용하였고, 이동상 A (0.1% formic acid in HPLC-grade water)와 이동상 B (0.1% formic acid in acetonitrile)를 이용한 gradient elution 조건에서 분석하였으며, 유속은 0.7 mL min-1, 총 분석 시간은 15분으로 설정하였다. 최종적인 MRM 데이터 처리는 Analyst software version 1.5.1과 MultiQuant™ software version 3.0.2 (SCIEX, Framingham, MA, USA)를 이용하였으며, 자세한 HPLC 및 질량분석기 조건은 Table 1Table 2에 제시하였다.

Table 1.

LC-MS/MS parameters for the analysis of antibiotics.

Instrument Parameter Conditions
HPLC Column ZORBAX Eclipse Plus C 18 (3.5 µm, 4.6 × 150 mm)
Guard column Security guard cartridge kit
Column temperature 25°C
Mobile phase A: 0.1% (v v-1) formic acid in water
B: 0.1% (v v-1) formic acid in acetonitrile
Flow rate 0.7 mL min-1
Inject volume 5 µL
Gradient Time
(min)
Mobile phase
A (%) B (%)
0 90 10
2 90 10
8 50 50
10 100 0
11 0 100
11.1 90 10
15 90 10
MS/MS Mode Electrospray ionization (ESI)
Polarity Positive (+)
Scan type Multiple reaction monitoring (MRM)
Curtain gas 30 psi
Collision gas High
Ion source temperature 500°C
Ion spray voltage 5,500 V
Table 2.

Mass spectrometry parameters with MRM transitions.

Compound Precursor ion
(m z-1)
Product ion
(m z-1)
DP
(V)
CE
(V)
Simeton§ 198.1 124.1 / 128.1 / 100.1 71 27 / 27 / 39
Ampicillin 349.9 106.1 / 192.0 / 113.9 6 41 / 21 / 41
Penicillin G 334.9 217.0 / 202.0 / 91.0 136 19 / 31 / 67
Chlortetracycline 479.0 444.0 / 462.1 / 260.0 66 31 / 23 / 73
Oxytetracycline 461.1 426.1 / 443.2 / 201.1 36 27 / 19 / 49
Tetracycline 445.1 410.1 / 427.1 / 154.2 26 29 / 19 / 37
Spiramycin 843.5 174.2 / 83.0 / 684.3 1 43 / 127 / 35
Tylosin 916.5 772.4 / 174.2 / 83.1 61 45 / 45 / 129
Sulfadiazine 251.0 156.0 / 92.0 / 65.0 1 21 / 33 / 61
Sulfamethazine 279.0 186.0 / 124.0 / 65.0 1 23 / 29 / 67
Sulfamethoxazole 254.0 156.0 / 92.0 / 65.0 1 21 / 33 / 61
Sulfathiazole 255.9 155.9 / 92.0 / 65.0 21 21 / 33 / 63

DP, declustering potential;

CE, collision energy;

§Internal standard.

Bold product ions were used for quantitation.

분석법 검증

잔류 항생제 분석법의 검증을 위해 농업 환경 시료에서 분석 대상 항생제의 회수율 실험을 수행하였으며, 이후 방법검출한계 (method detection limit, MDL) 및 정량한계 (limit of quantification, LOQ)를 계산하였다 (Englert, 2007). 분석법 검증을 위해 분석 대상 11종 항생제의 표준물질을 methanol에 녹여 표준원액 (100 mg kg-1)을 조제하였으며, 항생제 혼합 표준용액은 사용시 11종의 항생제 표준원액을 섞은 뒤 methanol을 이용하여 적절한 농도로 희석하여 사용하였다. 회수율 검증은 잔류 항생제가 존재하지 않는 대조구에 항생제 표준용액 (1.0 mg kg-1)을 인위적으로 첨가하여 분석하였으며, 최종적으로 기기 검출 농도와 첨가한 농도의 비율을 이용하여 회수율을 구하였다 (Table 3). 이후 낮은 회수율을 나타낸 항생제에 대해서는 매질보정 검량법 (matrix matched calibration)을 이용한 회수율 보정을 실시하여 분석을 진행하였다. 또한 회수율 실험 시 3반복 시험을 진행하여 그에 따른 상대표준편차 (relative standard deviation, RSD)를 계산하여 정밀도 (precision)를 평가하였으며, MDL 및 LOQ를 계산하기 위해서 먼저 예측 검출 한계를 구하였다. 예측 검출한계는 매체별 공시료를 다중 분석한 뒤 (n = 10), 분석 대상의 머무름 시간 근처에서 검출된 방해 피크 (noise peak)를 이용하여 농도의 표준편차를 구하였으며 이를 3배 한 값을 예측 검출한계로 하였다. 그 후 매체별 공시료에 예측 검출한계의 5배 농도의 표준용액을 첨가한 뒤 항생제 추출 및 기기 분석 과정을 거쳐 농도를 계산하였다. 이후 검출된 농도의 표준편차에 t 분포표에서 자유도 n - 1의 t 분포값인 3.143 (자유도 6, α = 0.02)을 곱한 값을 MDL, 표준편차에 10을 곱한 값을 LOQ로 하였다 (Table 4).

Table 3.

Recovery (Rec., %) and precision (%) of the analytical method for 11 antibiotics.

Compound River water Soil Compost Liquid manure
Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD Rec. RSD
Ampicillin 82.1 1.7 62.4 9.3 60.2 5.4 81.4 10.1
Penicillin G 101.6 0.9 78.9 9.1 119.7 5.8 81.6 7.1
Chlortetracycline 87.4 2.7 90.0 1.6 79.8 10.3 71.1 11.6
Oxytetracycline 92.2 6.6 110.0 12.7 105.8 2.5 106.7 5.5
Tetracycline 113.0 2.1 111.6 2.9 66.3 6.1 82.3 8.6
Spiramycin 59.1 6.7 57.5 2.4 101.3 13.7 102.7 9.5
Tylosin 115.8 33.9 99.5 2.2 96.0 11.4 77.0 6.1
Sulfadiazine 85.8 11.6 77.2 9.9 65.2 2.5 64.5 11.0
Sulfamethazine 112.4 5.0 74.3 11.1 108.5 2.9 63.4 14.2
Sulfamethoxazole 102.1 2.0 88.7 5.5 83.8 7.7 76.9 5.7
Sulfathiazole 63.3 1.3 65.9 7.0 59.1 6.0 80.4 8.0
Table 4.

MDL (ng L-1 or ng kg-1) and LOQ (ng L-1 or ng kg-1) of target analytes.

Compound River water Soil Compost Liquid manure
MDL LOQ MDL LOQ MDL LOQ MDL LOQ
Ampicillin 10.9 34.5 13.2 42.0 5.0 16.0 2.7 8.6
Penicillin G 12.0 38.1 8.5 27.0 15.6 49.5 9.1 28.8
Chlortetracycline 7.7 24.5 2.9 9.3 4.0 12.8 11.6 36.9
Oxytetracycline 8.7 27.6 8.7 27.6 10.4 33.0 11.4 36.3
Tetracycline 12.3 39.2 8.2 26.3 3.3 10.5 4.0 12.7
Spiramycin 2.2 7.0 1.2 4.0 1.5 4.7 3.4 10.7
Tylosin 2.1 6.6 4.9 15.6 1.0 3.2 1.2 4.0
Sulfadiazine 8.8 28.1 5.9 18.9 1.5 4.7 3.1 10.0
Sulfamethazine 6.6 20.9 2.9 9.2 2.1 6.5 2.8 8.9
Sulfamethoxazole 6.1 19.3 11.9 37.8 10.6 33.6 5.4 17.1
Sulfathiazole 7.2 22.8 3.6 11.3 4.5 14.3 3.0 9.6

통계 분석

시료의 이화학성 및 잔류 항생제 분석 시 모든 실험은 3회 반복 수행하여 평균과 표준편차 값으로 표시하였다. 또한 수집된 시료의 이화학성 데이터의 평균 비교를 위해 statistical package for social science (SPSS) version 26.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원분산분석 (one-way ANOVA) 및 사후분석 (Duncan’s test, p < 0.05)을 실시하였다. 또한 Pearson 상관 계수를 활용하여 토양의 이화학적 특성과 잔류 항생제 분포의 상관 관계를 파악하였다.

Results and Discussion

이화학성 분석 결과

수집된 시료의 이화학적 특성을 Table 5에 정리하였다. 토성 분석 결과 농경지 토양은 양토 (loam), 사양토 (sandy loam) 및 식양토 (clay loam)로, 저니토는 사양토 (sandy loam), 양질사토 (loamy sand) 및 식양토 (clay loam)로 구성되어 있었다. 농경지 토양의 pH는 4월 시료에서는 5.35 - 7.22의 범위, 7월 시료에서는 4.98 - 7.10의 범위로 나타났으며, 저니토 시료에서는 5.53 - 6.37 (4월) 및 5.40 - 7.32 (7월)의 범위로, 하천수 시료에서는 6.68 - 7.61 (4월), 6.68 - 7.10 (7월)의 범위로 나타났다. 농경지 토양의 EC는 0.34 - 2.62 dS m-1로 4월의 1번 지점을 제외하고는 모두 2 dS m-1 이하의 적정 토양 EC값을 나타내었으며, 저니토에서는 0.25 - 0.41 dS m-1, 하천수에서는 0.29 - 1.25 dS m-1의 범위로 나타났다. 농경지 토양에서의 유기물 함량은 4월 시료에서 1.65 - 3.55%, 7월 시료에서 1.55 - 3.24%의 범위로 나타났으며, 저니토 시료에서는 4월 및 7월 시료에서 각각 0.34 - 5.30% 및 0.43 - 5.84%의 범위로 조사되었다. 농경지 토양 유기물 함량의 경우 10번 지점을 제외하고는 모두 시간이 지남에 따라 감소하였으며 이는 토양 내 미생물 활동 등에 의해 유기물이 분해된 것으로 판단된다.

Table 5.

Physicochemical analysis of agricultural environmental samples.

Samples Site Soil texture pH EC (dS m-1) OM (%)
Apr. Jul. Apr. Jul. Apr. Jul.
Arable soil 1 Loam 6.32 d 7.00 b 2.62 a 0.53 f 2.55 c 2.11 d
2 Sandy loam 6.41 c 6.48 d 0.34 h 0.39 h 1.67 e 1.55 f
3 Sandy loam 7.22 a 6.81 c 0.39 cd 0.67 c 1.94 d 1.58 f
4 Sandy loam 5.71 f 7.10 a 0.95 b 0.61 d 2.50 c 1.91 e
5 Loam 5.62 g 6.13 f 0.41 c 0.71 b 2.59 c 2.36 c
6 Clay loam 5.35 h 4.98 h 0.39 d 0.81 a 3.55 a 3.24 a
7 Loam 5.36 h 7.06 a 0.38 e 0.67 c 2.87 b 2.61 b
8 Loam 7.06 b 5.82 g 0.37 f 0.52 g 1.66 e 1.62 f
9 Loam 6.03 e 6.16 f 0.35 g 0.57 e 1.65 e 1.81 e
10 Loam 6.29 d 6.24 e 0.37 ef 0.59 e 2.59 c 2.32 c
Sediment 1 Sandy loam 5.53 d 7.32 a 0.29 c 0.29 d 0.77 d 0.69 d
2 Sandy loam 6.37 a 5.43 d 0.38 b 0.63 c 2.68 b 2.89 b
3 Clay loam 6.09 b 6.54 b 0.41 a 0.98 b 2.05 c 1.69 c
4 Loamy sand 5.58 c 5.40 d 0.41 a 1.25 a 5.30 a 5.84 a
5 Sandy loam 5.60 c 6.15 c 0.25 d 0.32 d 0.34 e 0.43 d
Surface water 1 6.68 d 7.10 a 0.14 e 0.18 e
2 6.90 c 6.99 b 0.32 d 0.22 b
3 7.11 b 6.76 c 0.49 a 0.19 d
4 7.54 a 6.68 d 0.38 b 0.25 a
5 7.61 a 7.00 b 0.36 c 0.20 c
Compost 7.92 8.01 71.30 90.13 78.80 80.15
Liquid manure 7.70 7.75 98.00 94.11

Different letters in a column (in same samples) indicate significantly differences at p < 0.05.

농업 환경 시료에서의 잔류 항생제 분포 특성

농경지 토양, 저니토, 하천수, 가축분 퇴비 및 액비 시료에서 분석 대상 11종의 항생제 중 총 8개의 축산용 항생제가 검출되었다 (Tables 6 and 7). Penicillin 계열 항생제 중에서는 penicillin G만이 검출되었으며, 4월 농경지 토양 및 저니토에서 1.55 - 5.11 µg kg-1의 범위로 검출되었다. 그러나 나머지 모든 하천수, 가축분 퇴 ‧ 액비 시료에서는 검출되지 않았다. 일반적으로 penicillin 계열 항생제는 축산용으로 자주 이용되며 (Michalska et al., 2004; Watanabe et al., 2010; Liu et al., 2016), 농림축산식품부 등에서 발간한 ‘국가 항생제 사용 및 내성 모니터링’에 따르면 2021년 penicillin 계열은 총 305톤으로 국내 판매되는 축산용 항생제 중에서 가장 많은 부분을 차지하였다. 그러나 이처럼 많은 사용량 및 판매량에도 불구하고 penicillin 계열 항생제는 하천수 및 폐수나 토양과 같은 농업 환경 중에서 거의 검출되지 않거나 다른 항생제에 비해 낮은 농도로 검출된다 (Zhang et al., 2014; Mahmoudian et al., 2020). Hall et al. (2020)의 연구에서는 chlortetracycline을 돈분에서 10.39 mg kg-1로, 돈분을 시비한 토양에서 51.2 ng kg-1으로 검출하였지만, penicillin G는 돈분 및 토양에서 검출되지 않았다. 또한 Cha et al. (2006)은 도시 및 농업 지역의 폐수와 하천수에서 4종류의 penicillin 계열 항생제 (ampicillin, oxacillin, cloxacillin, cephapirin)의 분포를 분석하였으며, 이들은 폐수와 하천수에서 각각 15 - 17 ng L-1 및 9 - 11 ng L-1의 낮은 농도 수준을 나타내었으며 총 3%의 낮은 검출 빈도를 보였다. 이러한 결과는 베타-락탐 (β-lactam) 구조를 가지고 있는 penicillin 계열 항생제가 베타-락타메이스 (β-lactamase)나 화학적 가수분해로 인해 쉽게 분해되는 등 환경 중에서 짧은 반감기를 가지고 있기 때문이다 (Christian et al., 2003; Dinh et al., 2017). Tetracycline 계열 항생제 중 chlortetracycline은 81.8%의 검출 빈도로 다른 분석 대상 항생제보다 상대적으로 높은 검출률을 보였으며, 이들은 7월의 가축분 퇴비에서 568.84 µg kg-1로 가장 높았으며, 농경지 토양에서 5.22 - 203.36 µg kg-1의 범위를, 저니토와 하천수에서는 각각 3.02 - 132.40 µg kg-1 및 0.04 - 0.05 µg kg-1의 범위를 나타내었다. 반면에 oxytetracycline과 tetracycline은 모든 시료에서 각각 15.9%, 20.5%의 검출률을 나타내어 농업 환경 중에서 chlortetracycline보다 낮은 분포를 보였다. Tetracycline 계열 항생제는 높은 사용량으로 인해 농업 환경에서 자주 검출되는 축산용 항생제이며 (Lin et al., 2019; Paik et al., 2021), 특히 이들은 일반적으로 높은 흡착계수 (Kd)를 가지고 있고 토양 내 2가 금속 이온과 복합체를 형성하는 등 토양 내 잔류성이 높다 (Rabølle and Spliid, 2000; O’Connor and Aga, 2007). Paik et al. (2021)은 국내 가축분 퇴비를 시비한 토양에서 tetracycline 계열 항생제의 잔류성을 모니터링하였으며, tetracycline 계열 항생제 중 토양 내 잔류성이 높은 chlortetracycline이 토양에서 1.70 - 53.3 µg kg-1의 범위로 검출되어 oxytetracycline (5.38 - 56.5 µg kg-1) 및 tetracycline (4.65 - 38.7 µg kg-1) 보다 높은 농도 수준을 나타내었다. 본 연구에서도 chlortetracycline은 모든 농경지 토양 및 저니토에서 검출되어, 다른 tetracycline계열 항생제 보다 높은 검출 빈도를 나타내었다. 또한 ‘국가 항생제 사용 및 내성 모니터링’에 따르면 2021년 chlortetracycline의 총 판매량인 75톤 중 57톤이 돼지용으로 판매되었으며, 이는 전체 판매량의 76.3%를 차지하여 다른 축종보다 돼지에서의 높은 chlortetracycline의 판매량을 보였다. 이러한 높은 사용량은 돈분 및 가축분 퇴비에서 chlortetracycline의 잔류량을 증가시킬 수 있으며 (Hoese et al., 2009), 본 연구에서도 이러한 결과 때문에 농경지 토양에서 chlortetracycline이 높은 빈도로 검출되었다고 판단된다. 반면에 oxytetracycline의 경우 전체 판매량은 135톤으로 chlortetracycline보다 높은 판매량을 나타내었지만 수산용이 92.2%로 대부분을 차지하여 농업 환경에서 검출 빈도는 chlortetracycline보다 낮은 것으로 나타났다. Macrolide 계열 항생제 중에서는 tylosin만이 검출되었으며, 가축분 퇴비 및 액비에서 100%의 검출률로 각각 최대 178.36 µg kg-1, 41.33 µg kg-1의 범위로 나타났다. 하지만 이들은 하천수 시료에서는 검출되지 않았으며, 4월의 농경지 토양 및 7월의 저니토 시료에서 각각 한 점씩 13.50 µg kg-1 및 1.18 µg kg-1로 검출되었다. Tylosin은 macrolide 계열 중에서도 국내 가축용으로 가장 많이 이용되는 축산용 항생제로서 가축분뇨나 토양 등에서 자주 검출되는 등 환경 유출 가능성이 높으며 (Seo et al., 2007; Ho et al., 2014), Lee et al. (2010)의 연구에서도 계분 퇴비화 시설 인근 농경지 토양에서 tylosin을 0.07 - 40.57 µg kg-1의 범위로 검출하였다. 하지만 본 연구에서는 토양 내 tylosin의 검출 빈도는 낮았으며, 이는 환경 중에서 tylosin이 미생물 등에 의해 분해된 것으로 판단된다 (Teeter and Meyerhoff, 2003; Hu and Coats, 2007). 또한 같은 macrolide 계열인 spiramycin의 경우 모든 시료에서 검출되지 않았는데, 이는 2021년 기준 1.39톤으로 다른 항생제보다 상대적으로 낮은 사용량과 이로 인해 농업 환경 중으로의 유입 가능성이 적기 때문이라고 판단된다. 분석 대상 4종의 sulfonamide 계열 항생제 중 3종 (sulfamethazine, sulfamethoxazole, sulfathiazole)이 농업 환경 시료에서 검출되었다. 그 중 sulfamethoxazole은 45.5%로 sulfonamide 계열 중 가장 높은 검출률을 보였으며 농경지 토양 및 저니토에서 각각 0.08 - 42.68 µg kg-1 및 0.15 - 0.19 µg kg-1의 범위로, 가축분 퇴비 및 액비에서 11.25 - 271.23 µg kg-1로 검출되었다. 반면에 sulfathiazole은 6.8%의 낮은 검출률을 보였으며, sulfamethoxazole은 전체 시료 중 4월의 저니토 시료에서 0.91 µg kg-1의 농도로 한번 검출되었다. 일반적으로 수환경 (aquatic environment)에서 sulfonamide 계열 항생제는 낮은 Kd 값과 높은 수용해성 및 등으로 인해 토양 내 흡착성이 낮고 이동성이 높아 농경지 토양에서 낮은 농도 수준으로 존재하거나 자주 검출되지 않는다고 보고된다 (Lee et al., 2009; Conde-Cid et al., 2018; Kim et al., 2020). 본 연구에서도 sulfonamide 계열 항생제인 sulfamethazine은 4월 농경지 토양 시료에서 1번 지점 (42.68 µg kg-1)을 제외하고는 chlortetracycline보다 상대적으로 낮은 농도로 존재하고 있었으며, Zhou et al. (2013)의 연구에서도 돈사 인근의 밭 토양에서 sulfamethazine을 3.69 µg kg-1로 검출하여 tetracycline 계열보다 낮은 농도 수준 (37.3 - 667 µg kg-1)을 보였다. 또한 Hou et al. (2015)은 가축분 퇴비를 시용한 농경지 토양에서 chlortetracycline을 평균 1,520.6 µg kg-1의 농도로 검출하였지만, sulfamethoxazole은 평균 12.3 µg kg-1의 농도로 검출되어 토양에서 상대적으로 낮은 잔류 수준을 나타내었다.

Table 6.

Concentrations of VAs in agricultural environmental samples (April 2022).

Samples Site Antibiotic concentrations (µg L-1 or µg kg-1)
PNG CTC OTC TC TYL SMZ SMX STZ
Arable soil 1 ND 97.34 ND 6.89 13.50 42.68 ND ND
2 5.11 18.18 ND ND ND 0.64 ND ND
3 ND 16.92 ND ND ND 0.83 ND ND
4 ND 64.04 11.25 ND ND 0.53 ND ND
5 ND 9.59 ND ND ND 0.36 ND ND
6 3.05 5.26 ND ND ND 0.08 ND ND
7 1.91 9.50 1.08 ND ND 0.09 ND ND
8 2.33 4.51 0.40 ND ND <LOQ§ ND ND
9 1.74 10.23 1.32 ND ND <LOQ ND ND
10 1.55 5.29 0.57 ND ND <LOQ ND ND
Sediment 1 1.68 3.02 ND ND ND <LOQ ND ND
2 2.18 4.04 ND ND ND <LOQ ND ND
3 1.96 27.95 0.92 ND ND 0.15 ND ND
4 ND 4.45 ND ND ND <LOQ ND ND
5 ND 3.41 ND ND ND <LOQ 0.91 ND
Surface water 1 ND ND ND ND ND <LOQ ND ND
2 ND ND ND ND ND <LOQ ND ND
3 ND ND ND ND ND <LOQ ND ND
4 ND 0.05 ND ND ND <LOQ ND ND
5 ND 0.04 ND ND ND <LOQ ND ND
Compost ND 93.75 ND ND 10.47 48.29 ND ND
Liquid manure ND 14.68 ND 4.65 41.33 11.25 ND 1.26

Abbreviations: CTC, chlortetracycline; OTC, oxytetracycline; PNG, penicillin G; SMX, sulfamethoxazole; SMZ, sulfamethazine; STZ, sulfamethazine; TC, tetracycline; TYL, tylosin.

ND, not detected;

§<LOQ, concentration is less than the limit of quantification.

Table 7.

Concentrations of VAs in agricultural environmental samples (July 2022).

Samples Site Antibiotic concentrations (µg L-1 or µg kg-1)
PNG CTC OTC TC TYL SMZ SMX STZ
Arable Soil 1 ND 203.36 14.85 6.35 ND 0.66 ND ND
2 ND 10.25 ND 0.38 ND 0.18 ND ND
3 ND 14.32 ND 0.69 ND 0.06 ND ND
4 ND 12.31 ND 0.59 ND 0.17 ND ND
5 ND 5.22 ND ND ND 0.22 ND ND
6 ND 5.88 ND ND ND <LOQ§ ND ND
7 ND 7.26 ND ND ND <LOQ ND ND
8 ND 18.86 ND ND ND <LOQ ND ND
9 ND 11.47 ND ND ND <LOQ ND ND
10 ND 8.89 ND ND ND ND ND ND
Sediment 1 ND 3.24 ND ND ND ND ND ND
2 ND 3.84 ND ND ND 0.11 ND ND
3 ND 132.40 ND 8.82 1.18 0.19 ND 0.73
4 ND 5.70 ND 0.40 ND 0.16 ND ND
5 ND 4.82 ND 0.29 ND ND ND ND
Surface water 1 ND ND ND ND <LOQ ND ND ND
2 ND ND ND ND <LOQ ND ND ND
3 ND ND ND ND <LOQ ND ND ND
4 ND ND ND ND <LOQ ND ND ND
5 ND ND ND ND <LOQ ND <LOQ ND
Compost ND 568.84 ND ND 178.36 271.23 ND 238.72
Liquid manure ND 10.58 ND ND 19.59 23.60 ND ND

Abbreviations: CTC, chlortetracycline; OTC, Oxytetracycline; PNG, penicillin G; SMX, sulfamethoxazole; SMZ, sulfamethazine; STZ, sulfamethazine; TC, tetracycline; TYL, tylosin.

ND, not detected;

§<LOQ, concentration is less than the limit of quantification.

잔류 항생제의 계절적 분포 특성

검출된 잔류 항생제의 농도는 계절에 따라 다른 분포 특성을 보였다. Penicillin G의 경우에는 4월 전체 시료에서 45.5%의 검출률을 보였지만, 7월의 모든 시료에서 검출되지 않았다. 이는 환경 내 반감기가 짧은 penicillin G가 시간이 지남에 따라 토양 내에서 모두 분해된 것으로 판단된다 (Wang et al., 2018a). 광분해 (photolysis)는 환경 중 잔류 항생제의 분해 과정 중 하나이며 온도 및 습도 역시 항생제 분해에 영향을 미칠 수 있다 (Loftin et al., 2008; Timm et al., 2019). Tetracycline 및 sulfonamide 계열 등의 항생제는 하천수 등의 수중에서 태양광에 의해 분해될 수 있다고 보고되며 (Zessel et al., 2014; Wang et al., 2018b), Zhao et al. (2018)은 농경지 토양에서 여름철보다 겨울철에 더 높은 농도의 잔류 항생제를 검출하였고 이는 상대적으로 여름철에 더 높은 광량 및 온도 때문이라고 보고하였다. 본 연구 지역의 평균 기온은 4월의 경우 13.3°C, 7월은 26.4°C로 측정되었으며 시간이 지남에 따라 감소된 잔류 항생제는 7월의 강한 태양광 및 높은 기온 조건으로 인해 토양 표면이나 하천수에서 저감된 것으로 판단된다. 농업 환경에서 강우는 환경 중 항생제의 거동에 영향을 미칠 수 있다 (Kim et al., 2010; Le et al., 2018). 본 연구에서 7월 시료에서는 sulfamethazine의 농도는 0.06 - 0.66 µg kg-1의 범위로 검출되어 잔류 농도가 모든 시료에서 4월보다 평균 74.1% 감소하였다. 실제로 기상청에서 제공한 기상자료에 의하면 연구 대상 지역의 장마 기간은 2022년 6월 25일부터 7월 26일까지이었으며 (강수 일수: 17.7일, 평균 강수량: 378.3 mm), 장마 기간 동안 인해 수용해성이 높은 sulfamethazine이 토양에서 지하수 및 지표수로 침출된 것으로 판단된다 (Maszkowska et al., 2013; Spielmeyer et al., 2017). 또한 농경지 토양의 이화학적 특성은 자연적인 원인이나 인위적 활동으로 인해 계절별로 다른 양상을 나타낼 수 있으며 (Franzluebbers et al., 1995; Jiang et al., 2018; Lin et al., 2021), 이러한 이화학적 특성은 잔류 항생제 분포 및 거동에 영향을 미칠 수 있다 (Thiele-Bruhn, 2003; Sukul et al., 2008; Gong et al., 2012). 본 연구에서는 농경지 토양에서 100%의 검출 빈도를 나타낸 chlortetracycline을 대상으로 토양의 이화학적 특성과의 상관 관계를 분석하였다. 일반적으로 tetracycline 계열 항생제는 토양 내 유기물 및 점토 함량이 많을수록 토양 내 잔류성이 높아진다 (Fernández-Calviño et al., 2015; Conde-Cid et al., 2020). 이에 본 연구에서 분석한 농경지 토양의 유기물 함량 및 토성 분석을 통한 점토 함량과 토양 내 chlortetracycline 분포 간의 상관 관계를 분석하였으나, 토양 유기물 함량과 chlortetracycline 농도는 Pearson 상관 계수가 -0.133, 점토 함량에서는 -0.325로 나타났으며, pH와 EC에서도 각각 -0.05와 0.413을 나타내어 모든 이화학적 특성에서 상관 관계가 낮은 것으로 조사되었다. 하지만 본 연구는 실제 농업 환경에서 이루어졌기 때문에 지역 내 축산용 항생제 사용량 및 퇴비 사용량과 토양 내 여러 가지 이화학적 및 생물학적 특성들이 복합적으로 연관되어 있어 위와 같은 연구들과 다른 경향을 나타낸 것으로 판단되며 실제 농업 환경에서의 다양한 요인들을 고려한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Conclusions

본 연구에서는 농업 환경을 대상으로 두 차례에 걸쳐 축산용 항생제의 계절적 분포 특성을 분석하였다. 다양한 농업 환경 시료에서 11종의 분석 대상 항생제 중 8종이 검출되었다. 토양 내 잔류성이 높은 chlortetracycline은 농경지 토양 및 저니토에서 100%의 빈도로 검출되었으며, 액비화 시설의 영향으로 시설 인근 저니토에서 다른 지점보다 높은 수준의 chlortetracycline이 검출되었다. 7월 중 잦은 강우로 인해 토양 내 이동성이 높은 sulfamethazine의 농도가 모든 농경지 토양에서 감소하였다. 또한 penicillin G는 환경 중 짧은 반감기를 가지고 있어 7월 시료에서는 검출되지 않았다. 이처럼 농업 환경 중 축산용 항생제의 오염도는 계절적 변화에 영향을 받을 수 있으며, 잔류 항생제의 오염도 파악에는 단순한 농도에 의존한 모니터링이 아닌 복합적인 요소들을 고려해야 한다.

Acknowledgements

This work was carried out with the support of “Cooperative Research Program for Agriculture Science and Technology Development (Project No. PJ014885)” Rural Development Administration, Republic of Korea.

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